What's AD


알츠하이머 질환의 분자유전학

- 감마 시크리테아제의 구성과 생물학적 기능

서울의대 생화학교실  묵인희 교수   

   

 알츠하이머병 (Alzheimer's disease; AD)은 나이가 들어감에 따라 나타나는 퇴행성 신경질환이다. AD는 여러 가지 병인이 보고되어 지고 있지만 현재까지 알려진 가장 유력한 병인으로서 전구물질인 아밀로이드 전구단백질 (amyloid precursor protein; APP)로부터 AD 특이적 단백질 분해효소의 작용에 의해 생성된 단편인 베타아밀로이드 단백질 (amyloid β peptide; Aβ)이 뇌 조직에 침착되면서 뇌세포의 사멸을 일으킨다는 것을 들 수 있다. Aβ 생성의 마지막 단계에 작용하는 단백질 분해효소 중의 하나인 감마 시크리테아제는 이제까지 알려진 단백질 가수분해 효소들과는 달리 세포막 이중층 내에 존재하는 단백질의 소수성 부분을 가수분해하는 독특한 특성을 갖는 아스파르트산 단백질 분해효소다. 이 효소는 Aβ의 생성뿐만 아니라, Notch, E-cadherin, ErbB-4, CD44, Jagged, Delta 등의 기질을 분해하여 이들을 통한 세포내 신호전달기작에 중요한 역할을 담당할 것으로 생각되어지고 있다.

Presenilin (PS)은 유전적 알츠하이머병을 가진 가계에 대한 유전학적 연구에 기초하여 오랫동안 감마 시크리테아제의 유력한 후보 단백질로 여겨져 왔다. 그러나 최근의 연구들에 의해 nicastrin, APH-1, PEN-2라는 3가지 단백질이 PS와 함께 복합체를 이루어 활성을 갖는 감마 시크리테아제를 구성한다는 사실이 밝혀졌다. 이 네 가지 구성인자들은 세포내에서 정교한 기작에 의해 조절되면서 감마 시크리테아제의 활성을 조절하고 있으며 현재 각 구성성분들의 분자적 특성과 조절기작을 밝히려는 많은 연구들이 시도되고 있다.

 

서 론


   알츠하이머병 (Alzheimer's disease; AD)은 나이가 들어감에 따라 뇌에서 선택적으로 신경세포의 사멸이 일어나는 퇴행성 신경질환이다. AD에서 나타나는 조직병리학적 특징으로는 뇌 조직 내에서 세포 외부에 침착되는 노인반점 (senile plaque)과 신경세포 내부에 실타래처럼 뭉쳐서 축적되어지는 신경섬유덩어리(neurofibrillary tangle; NFT)을 들 수 있다. 노인반점의 주요 구성성분으로는 아밀로이드 전구단백질 (amyloid precursor protein; APP)에서부터 단백질분해효소들에 의해 잘려져 나온 베타아밀로이드 단백질 (amyloid β petide; Aβ)이 있다. 최근의 여러 가지 보고들에 의하여 Aβ가 AD의 여러 가지 병리학적 증상들을 일으키는 주요 병인으로 생각되어 지고 있다. Aβ는 APP의 N-terminal fragment (NTF)이 베타 시크리테아제라는 단백질 분해효소에 의하여 잘려진 후 남은 APP C-terminal fragment (CTF)가 다시 감마 시크리테아제라는 아스파트르산 단백질 분해효소에 의해 막을 관통하는 부분이 잘려서 만들어진다. 40개에서 42/43개의 아미노산을 가지는 형태로 나타나며, 이 중 Aβ42가 노인반점의 침착을 시작하는데 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있다.


아밀로이드 전구 단백질의 대사 과정

APP는 type I 막단백질로서 신경세포의 발생과 분화 및 생존에 주요한 역할을 하는 것으로 보고되어 졌다 (Perez et al., 1997). 이러한 APP는 신경세포에서는 특이적으로 APP695 형태의 단백질을 발현하는데 다른 조직에서는 APP751, APP770 형태의 단백질을 발현하고 있다.  APP의 대사 경로를 보면 정상인의 경우, 베타아밀로이드의 생성이 차단되어지는 non-amyloidogenic pathway가 진행되어지는데 이때에는 알파 시크리테아제라는 단백질 분해효소가 제일 먼저 작동하게 된다. 알파 시크리테아제에 의해 APP NTF (sAPPα)와 APP CTF (C83)가 생성되어지고 이것이 다시 감마 시크리테아제에 의해 절단될 경우에는 노인반점에 침착되지 않는 P3라는 Aβ보다 짧은 펩타이드와 APP intracellular domain (AICD) fragment가 만들어 진다. AD 환자에게서 나타나는 노인반점의 주요 성분인 Aβ를 생성하려면 APP가 베타 시크리테아제에 의하여 먼저 절단이 일어나게 되어 APP NTF (sAPPβ)와 APP CTF (C99)를 만들면서 amyloidogenic pathway로 접어들게 된다. 베타 시크리테아제에 의하여 잘려진 APP CTF (C99)는 다시 감마 시크리테아제에 의해 절단되어지고 이것은 뇌 조직에 침착되어 노인반점을 만드는 Aβ와 AICD를 생성하게 된다 (그림 1 참조). Aβ 생성에 관여하는 이러한 효소들은 AD 발생 과정의 초기 단계에 관여하기 때문에 AD 예방 또는 치료를 위한 약물 개발에 주요한 표적이 되고 있다.

                   < 그림 1. APP 대사 경로 모식도 >

APP 대사의 주요 경로에 관여하는 시크리테아제 중의 하나인 알파 시크리테아제는 아직 정확한 동정은 이루어지지 않은 상태이나, 이제까지의 연구들에 의하면 ADAM (a disintegrin and metalloprotease) family에 속하는 단백질 가수분해 효소인 ADAM 10과 TACE (tumor necrosis factor-alpha converting enzyme 혹은 ADAM 17)가 알파 시크리테아제 활성을 나타내는 단백질로 생각되고 있다 (Buxbaum et al., 1998).

베타 시크리테아제 활성을 나타내는 효소는 아스파르트산 단백질 분해효소의 특성을 갖는 BACE 1 (beta-site APP-cleaving enzyme) 이라는 type I 막단백질이다 (Hussain et al., 1999, Sinha et al., 1999, Vassar et al., 1999, Yan et al., 1999).  이 단백질을 과다 발현시키거나 RNAi로 발현을 감소시키면 sAPPβ (베타 시크리테아제에 의해 절단된 APP NTF)와 C99 (베타 시크리테아제에 의해 절단된 APP CTF)의 양이 증가되거나 감소되고,  세포내에서 APP와 동일한 cellular compartment 내의 분포를 보이며, 순수 분리된 단백질은 APP의 베타 절단부위 서열을 가진 합성 펩타이드를 절단할 수 있다. Aβ 생성에 BACE 1이 관여함을 확인하기 위해 만들어진 BACE 1 knockout 생쥐는 해부학, 조직 염색학 등의 소견에서 정상적인 표현형을 나타냄에도 불구하고, 배아의 대뇌 피질 신경세포에서 Aβ 분비가 완전히 사라졌으며, 이 생쥐를 APP를 과다 발현하는 생쥐와 교배시켰을 때에도 Aβ나 APP C99 fragment가 검출되지 않았다 (Cai et al., 2001, Luo et al., 2001). 이러한 연구결과로 볼 때, AD 치료를 위해 BACE 1을 억제하면 부작용이 상대적으로 적게 나타날 것으로 기대되어 적당한 억제제를 개발하기 위해 많은 노력이 기울여지고 있다.


감마 시크리테아제의 동정

감마 시크리테아제는 다른 시크리테아제보다 구조와 특성이 복잡하여 동정하는 데 많은 어려움이 있었다. AD 가계에서 presenilin (PS) 유전자에서 돌연변이가 발견되어 이 단백질이 감마 시크리테아제 활성을 갖는 단백질일 것이라고 예상되던 중, PS가 knockout된 생쥐의 신경세포에서 감마 시크리테아제에 특이적인 억제제를 처리했을 때와 마찬가지로, Aβ의 양이 현저히 감소되어 있고, APP C83과 C99가 축적된다는 결과가 보고됨으로서 이 단백질이 감마 시크리테아제를 구성하는 성분 중 하나임이 확실시 되었다 (Wolfe et al., 1999). 또한 peptidomimetic probe를 이용하여 감마 시크리테아제의 활성 부위를 찾고자 하는 실험에서 이 probe가 PS와 결합한다는 것을 보고함으로서 PS 그 자체가 아스파르트산 단백질 분해효소일 것이라는 가설을 제시하였다 (Wolfe et al., 1999). 실제로 PS의 6번째와 7번째 막 통과부위 내에는 진화적으로 보존된 아스파르트산 잔기 (Asp257과 Asp385)가 존재하는데, 이 두 잔기 중 하나에 돌연변이를 일으키면 감마 시크리테아제 활성이 억제되었고 (Kimberly et al., 2000), 활성을 갖는 감마 시크리테아제에 결합하는 아스파르트산 단백질 분해효소 전이상  유사물 (transition-state analog) 억제제가 PS1과 PS2에 직접 결합한다는 사실이 보고되어 (Esler et al., 2000), PS 자체에 감마 시크리테아제의 활성자리가 존재하며 Asp257과 Asp385가 그 활성자리를 구성한다는 가설이 제안되었다. 이러한 사실이 보고되면서 PS를 과다 발현하여 감마 시크리테아제의 활성을 조절하려는 시도가 있었으나, PS 만으로는 감마시크리테아제의 활성을 나타내기에 충분하지 않았다 (Thinakaran et al., 1997). PS 단백질은 약 50 kDa의 full-length로 합성된 후 presenilinase라는 현재까지 동정되지 않은 효소 활성에 의해 중간 부분이 잘려진 후 결합된 상태로 존재하는 안정한 PS NTF (~30 kDa)과 PS CTF ( ~20 kDa)을 만드는데, 이것이 PS의 활성형으로 생각되어졌다. 그러나 PS만의 과다발현으로는 감마 시크리테아제 활성이 증가되지 않았고, 단독으로 과다 발현된 PS는 세포내에서 급속하게 분해되는 것이 관찰되었기 때문에 PS NTF와 CTF의 양이 밝혀지지 않은 제한요소에 의해 정교하게 조절된다는 제한요소설이 대두되었다 (Steiner et al., 1998). 또한 감마 시크리테아제 활성을 나타내는 효소를 순수 분리하고자 한 여러 보고에서 사용된 방법에 따라 효소 복합체의 분자량이 최소 200-250 kDa부터, 440 kDa, 또는 2 GDa 까지 나타나 다른 복합체 구성 인자가 존재할 가능성을 강력하게 뒷받침했다 (Edbauer et al., 2002, Kimberly et al., 2003, Nyabi et al., 2003).

이 후 이 인자들을 찾기 위한 많은 노력들이 경주되던 가운데 첫 번째 PS 결합 단백질로 동정된 것이 nicastrin (Nct)이다 (Yu et al., 2000). Nct는 PS에 대한 면역 침전시 함께 침전되어 감마 시크리테아제의 한 성분임이 드러난 type I 막단백질로 약 80 kDa의 예상 분자량을 갖는다. 합성된 단백질은 소포체 (endoplasmic reticulum; ER)에서 약 110 kDa의 N-linked glycosylation만 일어난 상태인immature form으로 변형되어 세포막으로 이동하면서 약 130 kDa으로 maturation (complex N-linked glycosylation)된다. C. elegansDrosophila에서 Nct 유전자의 발현을 억제하면 PS의 발현을 억제했을 때와 동일하게 Notch 신호 전달 기능이 억제되었다 (Lopez-Schier and St Johnston, 2002). 또한 Nct의 maturation은 PS에 의존적으로 PS가 없을 경우에는 정상적 세포내 이동 경로를 따르지 못하고 ER에 축적됨을 확인하였다 (Edbauer et al., 2002, Kimberly et al., 2003). Nct을 단독으로 과다 발현시키면 단백질의 증가가 관찰되지 않은 반면, siRNA를 통한 발현 억제 시에는 PS의 양이 감소하는 현상이 관찰되어, PS NTF/CTF 활성형을 안정화시키는 역할을 할 것으로 추측되고 있으며, 활성이 있는 감마 시크리테아제와 물리적으로 결합한다는 사실도 보고되었다.

 그러나 PS와 Nct의 과다발현은 PS만의 과다발현과 마찬가지로 감마 시크리테아제 활성 증가를 일으키기에는 충분치 않았다는 것은, PS와 Nct 외에도 또 다른 제한 인자가 존재함을 의미하는 것이다. 따라서 이를 찾기 위한 많은 연구가 시도되던 중 C. elegans에 대한 유전자 탐색을 통해 anterior pharynx defective-1 (APH-1)과 presenilin enhance-2 (PEN-2)라는 2개의 새로운 후보 유전자가 동정되었다 (Francis et al., 2002, Goutte et al., 2002). 약 30 kDa의 분자량을 갖는 APH-1은 7개의 막통과부위를 갖고 그 유전자를 돌연변이 시키면 LIN-12, APH-2, 또는 SEL-12 (각각 C. elegans의 Notch, Nct, PS ortholog)를 돌연변이 시켰을 때와 마찬가지로 불임효과를 유발했다. 이러한 효과는 Notch에 의한 신호전달 경로를 차단했을 때와 동일한 것으로 APH-1 활성이 PS와 마찬가지로 Notch 신호전달경로 상에 필요함을 나타낸다. PEN-2는 약 12 kDa의 2개의 막통과부위를 가진 단백질로 C. elegans에서 제거되면 Notch, PS, Nct, APH-1의 유전자를 knockout시켰을 때와 유사한 표현형을 나타낸다. Drosophila S2 세포에서 4가지 단백질(PS, Nct, APH-1, PEN-2) 각각에 대하여 RNAi로 발현을 감소시키면 감마 시크리테아제 활성이 감소되었고, 반대로 C. elegans knockout에 대한 회복실험에서도 4 가지 단백질이 모두 필요한 것으로 나타났다. 선충류나, 초파리 세포를 이용한 경우와 마찬가지로, 포유동물 세포를 이용한 면역침전실험에서도 4 가지 구성성분은 각각에 대한 항체로 면역침전 하였을 때, 다른 감마 시크리테아제 구성요소들도 함께 침전되어 4 가지 단백질이 복합체에서 물리적으로 결합하고 있음이 밝혀졌다. Nct과 PEN-2에 대한 RNAi 또한 포유동물 세포에서도 동일한 결과를 나타냈다. 4 가지 단백질 모두를 동시에 발현되었을 때에만 감마 시크리테아제 활성이 증가한다는 것을 보인 여러 보고들로 볼 때, 이 4 가지 요소들이 오랫동안 생각되어온 PS의 제한인자일 것으로 추측할 수 있다. 다시 말해 4 가지 구성요소들은 협동적으로 서로의 maturation 및 stability를 조절하기 때문에 세포내에서 가장 소량으로 존재하는 요소가 PS의 절단, Nct의 maturation, 감마 시크리테아제의 활성에 대한 제한 인자로 작용한다는 것을 의미하며, 이 4 가지 단백질이 감마 시크리테아제의 양에 대한 정교한 조절을 극복하고 그 활성을 증가시키기 위한 최소한의 성분일 것으로 생각된다. 이러한 현상은 4 가지 요소가 활성을 나타내는 최종단계의 성분이 아니라 각 성분이 감마 시크리테아제 활성화의 여러 단계 중 어떤 한 단계에만 필수적으로 작용할 때도 나타날 수 있다. 그러나 감마 시크리테아제의 활성형만을 분리하여 네 가지 성분을 존재를 확인하는 실험을 통해 활성형의 효소에 네 가지 단백질이 모두 존재한다는 것이 확인되었다 (Kimberly et al., 2003). 이 보고에서는 활성형 복합체의 분자량이 200-250 kDa으로 네 가지 단백질이 1:1:1:1의 비율로 존재할 것을 제안하였는데, 다른 그룹에서는 사용된 방법에 따라서 더 큰 분자량의 복합체들을 분리할 수 있음을 보고했고 PS에 2가지 homolog (PS1 & PS2)가 존재하고 포유동물의 APH-1에 3가지 형태 (APH-1aS, APH-1aL, APH-1b)가 존재함을 감안할 때 복합체에 각 성분이 하나 이상 존재하거나 또 다른 구성성분이 존재할 가능성은 여전히 남아있다.

 이상의 보고들을 종합하여 볼 때 감마 시크리테아제 복합체 형성의 모식도를 그려 보면 다음과 같다 (그림2 참조). 처음에 Nct이 APH-1과 low molecular weight subcomplex를 형성하여 두 단백질이 서로를 안정화 시킨다. 여기에 full length의 PS가 결합을 하여 안정화 된 high molecular weight subcomlex를 형성하며 마지막으로 PEN-2가 결합함으로써 PS의 절단이 일어나게 된다. PS NTF/CTF, PEN-2, Nct, APH-1은 활성을 가진 감마 시크리테아제 복합체로서 APP 등 여러 가지 기질을 절단할 수 있게 된다. 여기에 아직까지 알려지지 않은 다른 요소가 더 해질 가능성을 배제할 수 없으며 이러한 unknow factor가 기질 특이성을 조절할 수도 있다는 추측을 할 수도 있겠다. 


                                                  

< 그림 2. 감마 시크리테아제 복합체 형성 모식도 >


감마 시크리테아제의 생리적 기능

감마 시크리테아제 복합체의 생리적 기능에 대한 연구로는 감마 시크리테아제의 기질이 APP 뿐만이 아니라 Notch도 있다는 것이 알려 지면서 그 기능의 중요성이 다시 부각되어졌다. C. elegans에서 PS의 ortholog인 SEL-12가 동정되면서 감마 시크리테아제가 발생단계에 관여할 것이라는 가설이 제기되었다 (Levitan and Greenwald, 1995).  이 보고에서는 SEL-12/PS 단백질이 C. elegans의 생식기 발생에 중요한 LIN-12/Notch 신호전달 경로상에 존재함을 보여주었다. Notch는 Drosophila에서 처음 동정된 type I 막투과 수용체로서 부분적인 기능소실 돌연변이에 의해 금이 간 날개와  과도한 양의 신경원세포가 형성되는 표현형을 나타낸다. 이후의 연구로 Notch 신호전달이 발생과정 중 세포의 운명 결정에 관여함을 확인되어짐에 따라 감마 시크리테아제가 발생과정에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다  (Artavanis-Tsakonas et al., 1999). 감마 시크리테아제가 Notch를 잘라 신호를 전달한다는 사실로 볼 때 APP도 감마 시크리테아제에 의해 신호전달에 관여할 수 있음을 추측할 수 있다. 실제로 APP가 감마 시크리테아제에 의해 절단될 때 만들어지는 세포내 절편인 AICD는 Fe65라는 단백질과 복합체를 형성하여 핵으로 들어가고, 실제로 특정 유전자의 전사를 조절한다는 보고가 있었다 (Cao and Sudhof, 2001, Baek et al., 2002).

Notch, APP 뿐만 아니라 이전에 알려진 몇 가지 type I 막 단백질들이 최근 감마 시크리테아제의 기질인 것으로 밝혀졌는데, 세포 결합을 매개하는 Epithelial cadherin (E-cadherin) (Marambaud et al., 2002)과  CD44 (Lammich et al., 2002, Murakami et al., 2003), EGF 수용체인 ErbB-4 (Ni et al., 2001), Notch ligand인 Delta와 Jagged (Ikeuchi and Sisodia, 2003), 그리고 NGF에 대한 저친화도 수용체인 p75NGFR(Jung et al., 2003) 등이 그것이다. 이것은 감마 시크리테아제가 막에 존재하는 많은 단백질의 일부분이 세포내로 방출되는데 폭넓은 기능을 갖는다는 것을 의미한다. 따라서 감마 시크리테아제의 주요 기능은 어떤 세포 표면 수용체의 일부를 세포 내로 들여보내 외부의 신호를 세포내로 전달하는 것일 수 있다.

그러나 출생과 동시에 감마 시크리테아제 복합체 각각의 구성 인자들의 발현은 일어나는 것이므로 생체 내에서 이러한 감마 시크리테아제의 활성을 직접적으로 조절하는 기전이 분명히 존재할 것으로 생각되어지고 있으며 이러한 기전들로서 노화, 스트레스, 뇌의 염증 반응 등을 추측할 수 있으나 이에 관한 직접적은 연구 증거들은 없는 실정이다.


AD 약물표적으로서의 감마 시크리테아제

현재까지의 연구에 의하면 베타와 감마 시크리테아제에 의해 만들어진 Aβ의 증가와 침착은 AD의 주요 병인으로 생각되고 있으므로, 이 과정을 억제하는 것이 AD의 예방을 위한 하나의 전략이 될 수 있다. 그러나 감마 시크리테아제는 APP 뿐 아니라 Notch 등 몇 가지 다른 단백질에 의한 신호전달 경로에 있어서도 주요하게 작용하기 때문에 AD의 치료 또는 예방을 목적으로 그 활성을 완전히 억제하는 것은 심각한 부작용을 유발할 것으로 추측된다. 따라서 Aβ의 생성을 효과적으로 줄이면서 이러한 부작용을 최소화하는 방안이 필요할 것이다.

첫 번째 방법은 감마 시크리테아제를 부분적으로 억제하는 것이다. 이러한 전략은 심장병을 예방하기 위해 널리 사용되고 있는 콜레스테롤 저하제의 사용에서 그 예를 찾아볼 수 있다. HMG-CoA 환원효소를 완전히 억제하면 세포막 대사에 심각한 문제를 일으키지만, 스타틴 계열의 억제제를 사용하여 부분적으로 억제하면 부작용은 거의 일으키지 않으면서 혈액 내 콜레스테롤 양을 감소시켜 심장 및 뇌와 관련한 혈관질환의 위험을 유의하게 낮출 수 있다. 따라서 적은 양의 감마 시크리테아제 억제제를 지속적으로 사용하면 이와 유사하게 AD의 발생위험을 감소시키기에 충분할 정도로 Aβ의 생성을 감소시킬 수도 있다. 두 번째 방안은 감마 시크리테아제 억제제를 베타 시크리테아제에 대한 억제제와 함께 사용하는 것이다. 앞서 언급한 바와 같이 베타 시크리테아제는 그 활성을 완전히 제거해도 심각한 부작용을 일으키지 않았고, Aβ 생성과정에서 베타 시크리테아제의 작용은 감마 시크리테아제보다 앞서 일어나기 때문에 두 효소를 동시에 부분적으로 억제하면 각각을 크게 억제하는 것보다 부작용의 위험을 낮추면서 Aβ의 생성을 억제하는 데는 시너지적인 효과를 나타낼 수도 있을 것이다. 마지막으로 감마 시크리테아제의 기질 특이성을 이용한 전략으로, 최근에 발겨진 감마 시크리테아제의 구성성분에 대한 생화학적, 생리적 특성에 대한 연구는 감마 시크리테아제의 기질 특이성에 대한 분자적 이해를 넓혀 APP 대사만을 선택적으로 억제하는 약물을 개발하는데 표적으로 이용될 수 있을 것이다. 또한 실험 방법에 따라 다양하게 나타나는 효소 복합체의 크기를 고려할 때, 더 큰 복합체에는 감마 시크리테아제에 기질 특이성을 가져다주는 아직 밝혀지지 않은 또 다른 인자가 존재할 가능성이 있어 이에 대한 연구가 지속되어져야 할 것이다.

 

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